測定意義：

Cx（EC3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚體。

測定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測定Cx催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

組成：

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴2h

混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，取200μl至微量石英比色皿或96孔板中，測540nm下吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

Cx活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y為吸光值。

2、血清（漿）Cx活力的計算

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中Cx活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11ml； V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y為吸光值。

2、血清（漿）Cx活力的計算

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷V樣÷T

=28.61×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中Cx活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.057×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/ml=1000ug/ml；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11ml； V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。