在單細胞懸液制備中，最難制備的莫屬原生質體制備了。為解決這一難題，今天小歐根據(jù)以往的經(jīng)驗，給大家?guī)硪淮谓炭茣墑e的關于如何制備高質量原生質體的分享。

原生質體介紹

1、什么是原生質體

     原生質體 (protoplast)：脫去細胞壁的細胞稱為原生質體，它是一個生物工程學的概念，是組成細胞的一個形態(tài)結構單位，動物細胞也可算做原生質體。在細胞學歷史上，“細胞”(cell) 一詞最早由 Hooke 提出的，意為“小室”，后來發(fā)現(xiàn)了原生質，對細胞的認識與 Hooke 時期不同了，1880 年由 Hanstein 提出“原生質體”一詞。由于細胞一詞的出現(xiàn)較原生質體早，故沿用至今。

2、獲得原生質體有什么重要作用

    原生質體應用非常廣泛，例如：由于細胞壁會阻止 DNA 進入細胞，原生質體被廣泛用于 DNA 轉化；可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的攝取；用于體細胞的變異克??；使用原生質體融合技術將原生質體用于植物育種等；此外，在某些細胞中表達熒光蛋白的植物的原生質體可用于熒光活化細胞分選（FACS），方便保留特定波長發(fā)熒光的細胞。  

    另外，原生質體是一種非常好的瞬時表達系統(tǒng)。原生質體瞬時表達技術被廣泛應用于基因功能研究、植物生理生化過程研究和分子機制的研究（包括研究細胞信號轉導過程、離子轉運、細胞壁合成、蛋白質分泌以及細胞程序化死亡等生物學過程），以及生產(chǎn)有用的代謝產(chǎn)物、構建植物融合細胞、創(chuàng)制多倍體等。

現(xiàn)在已有的基于原生質體的實驗技術包括蛋白亞細胞定位分析、基因瞬時表達分析、啟動子活性分析、離子吸收實驗以及蛋白質互作驗證（如 Bi-FC、FRET 和蛋白質免疫共沉淀）等。

3、目前原生質體獲得存在哪些限制

     植物細胞壁不易破壞分解，葉綠體含量太高，碎片雜質占比太高以及容易被染菌等，成為當下植物解離獲取原生質體的幾大阻礙，如何高效獲取高質量原生質體成為當下亟需攻克的實驗難題。

酶解法

      酶解法以其得率高、活率好、雜質少的特點毋庸置疑成為原生質體制備的首要方法。下面就由小歐向大家分享一下植物原生質體解離的獨家秘方。

酶解法分離原生質體的靈魂就是酶分解細胞壁。植物細胞壁的組成分主要是纖維素、半纖維素、果膠、蛋白質等。選擇植物原生質體分離用酶主要有：纖維素酶 R-10、半纖維素酶 、果膠酶 Y-23、離析酶 R-10 及崩潰酶等 , 其中纖維素酶 R-10、果膠酶 Y-23 最為常用。葉片類組織樣本解離時，在酶解液中添加半纖維素酶可以提高消化效率；根系組織解離時，在酶解液中添加離析酶并適當提高果膠酶 Y-23 的濃度可以提高消化效率。

在前期條件摸索時，可以先確立以纖維素酶 R-10、果膠酶 Y-23 為基礎酶解液配方，根據(jù)出現(xiàn)的實驗情況來對酶解液進行優(yōu)化，以下是詳細說明：

(旁白：福利來啦，小歐首次公開酶解液的配方哦，絕對的史無前例呀。)

獨家配方

1、確定基礎酶解液配方（添加量需要通過終濃度結合使用的具體品牌的試劑信息進行計算）：

2、取材篩選：葉片組織取材時優(yōu)先選取顏色為鮮綠色且葉片較為柔軟的部分進行實驗（如下圖所示）；

根部組織取材優(yōu)先選取狀態(tài)飽滿、水嫩的根部進行實驗；莖部組織取材時需要注意剝去有韌性的外表皮后進行實驗。實驗摸索前期組織量要盡可能的多，推薦鮮重 0.25-2 g 的組織進行酶解實驗。

水稻節(jié)間剝去外表皮后效果圖

水稻黃化葉片解離摸索使用組織圖

3、酶解消化：酶解的過程實質就是通過物理方法使植物組織有足夠的切口暴露在酶解液中，通過酶解液分解細胞壁繼而使原生質體游離于切口處，然后通過搖床等溫和振蕩的方法幫助已經(jīng)無壁的原生質體從切口處游離至酶解液中，最后通過富集純化得到高質量的原生質體懸液。

實驗過程中常見的 FAQ

Q1: 酶解得到的原生質體活率低有哪些原因？要如何避免這種現(xiàn)象？

A1: 酶解得到原生質體活率低可以分為以下幾個方向：

1. 酶解 30 min-1 h 鏡檢原生質體活率低。首先要檢查酶解液的 PH 是否低于 5.5，酶解液 PH 較低會影響原生質體狀態(tài)；其次檢查酶解過程中是否進行了避光措施，不采取避光措施會對原生質體質膜造成傷害從而導致活性降低。

2. 酶解時間超過某一時間后活率出現(xiàn)下降，這種情況是因為酶解時間過長導致的原生質體活率下降。

上圖為 PH 試紙檢測酶解液 PH

Q2: 酶解原生質體得率很低是什么原因造成的？

A2: 原生質體得率低最大可能是酶解液未能很好的接觸切口，比如水稻葉片組織，本身不易浸入酶解液中，可以通過真空泵輔助的方法使酶解液進入組織內部，從而提高原生質體得率；還有可能是原生質體沒能很好的從切口處游離出去，可以使用更高轉速的搖床來輔助原生質體釋放，或者通過對酶解后組織的輕微擠壓來幫助原生質體釋放。

葉片浸潤于酶解液中   

真空泵輔助葉片浸入酶解液

Q3: 如何降低原生質體懸液中的碎片占比？

A3: 目前雖可以通過梯度離心的方法對原生質體懸液進行純化，但這種方法的得率低，需要大量的原生質體來支撐，因此降低碎片最好的方法是優(yōu)化取材部位，可以通過剝去外表皮、棄去狀態(tài)不好的組織(失水組織、被擠壓后的組織、質地堅硬的組織)、使用鋒利的刀片劃切組織代替剪刀處理組織來減少碎片的投入量，也更能保障原生質體的活率。

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