登革病毒（DENV）是一種通過蚊子傳播的病毒，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行。它就像一個隱藏在暗處的 “健康殺手”，全球每年有超過 390 萬人感染，約 2.5 萬人因此失去生命。DENV 有 4 種血清型，分別是 DENV-1、DENV-2、DENV-3 和 DENV-4，每種血清型還包含多種基因型，這使得它的 “身份” 復(fù)雜多變。感染 DENV 后，患者的癥狀輕重不一，從輕微的登革熱到嚴重的登革出血熱和登革休克綜合征，嚴重威脅著人們的生命健康。

目前，還沒有針對 DENV 的有效疫苗和特效治療藥物，因此早期檢測就顯得尤為重要。然而，傳統(tǒng)的檢測方法，如病毒分離、血清學(xué)檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實時定量 RT-PCR（qRT-PCR）等，存在著諸多不足。這些方法要么依賴特定的 DENV 抗體、昂貴的設(shè)備，要么需要專業(yè)技術(shù)人員操作，在資源有限的地區(qū)難以推廣使用。

為了解決這些問題，海軍軍醫(yī)大學(xué)的研究人員開展了一項關(guān)于登革病毒檢測的研究。他們將重組酶聚合酶擴增（RPA）技術(shù)與成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）及相關(guān)蛋白 12a（CRISPR/Cas12a）系統(tǒng)相結(jié)合，開發(fā)出了一種新型的一鍋法通用 DENV 檢測系統(tǒng)，并建立了相應(yīng)的基于 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 的側(cè)向流動試紙條（LFD）檢測平臺。

在這項研究中，研究人員用到的主要關(guān)鍵技術(shù)方法包括：基于 DENV 基因組保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和 Cas12a crRNA；利用商業(yè)化試劑盒進行 RT-RPA 反應(yīng)和 CRISPR/Cas12a 檢測反應(yīng)；通過核酸提取、質(zhì)粒稀釋等操作進行靈敏度和特異性分析；使用側(cè)向流動試紙條進行可視化檢測 。

研究結(jié)果如下： 

工作流程與體系構(gòu)建：建立了一鍋法 RPA CRISPR/Cas12a 檢測 DENV 的工作流程。先從感染樣本中提取核酸作為模板，用基于 DENV 四種血清型保守區(qū)域設(shè)計的通用引物進行 RT-RPA 擴增，再將 CRISPR/Cas12a 檢測反應(yīng)體系通過離心與擴增產(chǎn)物混合，利用 FAM 標記的單鏈 DNA 報告分子進行檢測，整個過程 40 分鐘內(nèi)完成，并成功建立了 LFD 平臺。

引物和 crRNA 篩選：設(shè)計合成 2 條正向和 7 條反向 RPA 引物，經(jīng)篩選，F(xiàn)1/R1 引物對擴增效果最佳；設(shè)計 4 種 crRNA，評估后 crRNA2 性能最優(yōu)。

反應(yīng)條件優(yōu)化：對 Cas12a 和 crRNA 濃度進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn) 500 nM Cas12a 和 1000 nM crRNA 時檢測反應(yīng)熒光強度最高；確定 38℃為最佳反應(yīng)溫度。

靈敏度和特異性分析：該檢測系統(tǒng)的檢測限（LOD）為 91.7 copies/test；對 26 個病毒感染細胞樣本檢測，能準確識別所有 DENV 陽性樣本，與其他 4 種干擾病毒無交叉反應(yīng)，特異性達 100%。

檢測系統(tǒng)驗證：用合成的包含 DENV-1 至 DENV-4 核酸序列的重組質(zhì)粒進行檢測，證明該平臺可成功識別 4 種 DENV 血清型；LFD 平臺也能準確識別 4 種 DENV 血清型，確定 25 nM 為 ssDNA 報告分子的合適濃度，其檢測靈敏度約為 250 copies/test。 

研究結(jié)論和討論部分指出，該一鍋法 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 檢測系統(tǒng)對 DENV 檢測具有高特異性和靈敏度，且無假陽性結(jié)果。相比傳統(tǒng)方法，它無需復(fù)雜設(shè)備，檢測時間短，能降低交叉污染風(fēng)險，減少誤診。該系統(tǒng)不僅能檢測所有 4 種 DENV 血清型，在臨床登革熱檢測中具有應(yīng)用潛力，而且 LFD 平臺成本低、操作方便，在資源有限地區(qū)有很大的應(yīng)用前景，為即時檢驗（POCT）和體外診斷（IVD）產(chǎn)品開發(fā)提供了支持 。不過，CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)不能忽視，后續(xù)還需進一步研究優(yōu)化。總的來說，這項研究為 DENV 檢測提供了新方法，也為其他人類病毒檢測方法的開發(fā)提供了思路，相關(guān)研究成果發(fā)表在《BMC Microbiology》上。

相關(guān)產(chǎn)品：RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列